Tüm biyolojik mikroskoplar, numunelerindeki kontrastı arttırma girişimlerinde travmalarla karşı karşıyadır. Karbon bazlı yaşam formları, elektron mikroskobunda esasen saydam hale gelen esas olarak ışık elementlerinden oluşur. Sabit ve gömülü örneklerin pozitif boyanması ve bir destek filminde biriken tüm yapıların negatif boyanması için geleneksel olarak ağır metal tuzları eklenir.

Faz kontrast ışık mikroskobu uzun zamandır canlı hücre görüntüleme için vazgeçilmez bir araç olmuştur. Zernike tarafından 60 yıldan daha uzun bir zaman önce gösterildiği gibi, ışık mikroskobunun kırınım düzlemine bir faz plakası yerleştirilmesi yüksek kontrastlı görüntüler üretir. Bu etkili teknik, son zamanlarda transmisyon elektron mikroskopisine başarıyla uygulanmıştır.

Bir Zernike faz plakası TEM için kolon tasarımı Şekil l'de gösterilmektedir. Faz plakası, objektif lensin arka odak düzlemine yerleştirilmiş küçük bir merkezi delik ile uygun kalınlıkta kesintisiz amorf bir karbon filmden oluşur. Sıfır dereceli ışın merkezi delikten geçerken saçılmış elektronlar -π / 2 ile faz değiştirilir, bu da örnek kontrastında üç ila beş kat artışa neden olur.

Faz plakasının etkisi, geleneksel ve faz plakası TEM'in kontrast transfer fonksiyonlarının (CTF) karşılaştırılması olan Şekil 2'de gösterilebilir. Siyah renkle gösterilen konvansiyonel TEM için CTF, sinüs tipi bir fonksiyondur ve düşük frekanslı bileşenler büyük ölçüde bastırılır ve boyanmamış numunelerin görüntülerinde düşük kontrast oluşturur. Kontrastı artırmak için optimum odaklanmada veya bir dizi odaklanma ayarında veri almak yaygın bir uygulamadır. Mavi renkte gösterilen TEM faz plakası için CTF, düşük frekans bileşenlerinin gelişmiş kontrastıyla kosinüs tipi bir fonksiyondur. Faz plaka görüntüleri, gerçek netlemeye yakın yüksek kontrast sağlar ve görüntüleri yorumlamak için CTF düzeltmesi gerekmez.

Profesör Kuniaki Nagayama'nın laboratuarı TEM için faz plakalarının kullanılmasını destekledi. Kendisi ve meslektaşları, düşük kontrastlı, vitrifiye edilmiş makromoleküllerin faz kontrast TEM görüntüleme potansiyelini göstermiştir. Konvansiyonel TEM'de, donmuş hidrate veya boyanmamış biyolojik numunelerin görüntüleri, ilgilenilen alanları bulmak için düşük uzaysal frekanslarda yeterli faz kontrastı üretmek için yüksek miktarda netleme ile kaydedilmelidir. Bu tür görüntüleme koşulları yüksek çözünürlük detayını feda ettiğinden, faz plakası gibi alternatif kontrast arttırma yöntemleri uygulanmalıdır.

Faz kontrast TEM'in tek partikül analizine etkisi çok yönlüdür. Danev ve Nagayama'nın 12Å çözünürlükteki 3 boyutlu GroEL modeli, faz kontrast görüntülerine dayanarak, geleneksel bir görüntü setine kıyasla% 30 daha az parçacık gerektiriyordu, özellikle düşük konsantrasyonda mevcut olan heterojen örnekleri, düşük simetriye sahip örnekleri inceleyen bilim adamları için kritik öneme sahipti.

Faz kontrastı için en uygun tasarım, kriyo-elektron tomografisi, görüntü kontrastını maksimize etmek için tüm optik elemanların dikkatlice değerlendirilmesini gerektirir ve özel bir sütun konfigürasyonunda gerekli olan özellikler, JEM-2200FS'ye dahil edilmiştir. JEM-2200FS 200kV TEM, bir alan emisyon tabancası, ısıtılmış faz plakası tutucusu, faz plakası tutucusunu yerleştirmek için 5mm veya daha büyük bir objektif odak uzaklığı ve ayrıca bir ısı kalkanı olarak hizmet etmek için oda sıcaklığında bir açıklığa sahiptir. Faz plakası tutucu, hassas konumlandırma için piezo sürücüler ve şarj ve kirlenmeyi en aza indirmek için faz plakasının 200ºC'ye kadar sürekli ısıtılmasını içerir. Faz plakasının merkezi deliğinin küçük boyutu, tüm düşük doz modlarında ve eğim açılarında paralel aydınlatmayı ortalamak için doğru yazılım kontrolü gerektirir. Sütun içi Omega filtresi tarafından sağlanan sıfır kayıplı enerji filtrelemesi kabaca sinyal-gürültü oranını iki katına çıkarır ve kalın örnekleri görüntülerken esnek olmayan saçılmayı gidermek için esastır. Bu tasarımın JEM-2200FS'de gerçekleştirilmesi, vitrifiye proteomın pratik incelemesini, 100kDa kadar küçük nanomakinleri içerecek şekilde genişletmelidir.